RESUMO

INTRODUÇAO: Queimaduras cutâneas sao lesoes geralmente causadas pela energia térmica da transferência de calor, que determina um processo cicatricial desordenado. Para entender o processo e para avaliar possibilidades terapêuticas, sao necessários modelos animais, assim como a padronizaçao da elaboraçao da queimadura experimental.
OBJETIVO: Detalhar uma técnica que promove queimaduras padronizadas de espessura total da pele em ratos Wistar.
MÉTODO: Realizaram-se queimaduras padronizadas em 22 ratos Wistar divididos aleatoriamente em GI e GII. Acoplou-se à extremidade de um ferro de solda uma peça cerâmica de 484mm² de superfície, que em contato com a pele durante 30 segundos, aquecida a 100° Celsius com uma pressao de 54 gramas, exercida pela própria massa do ferro da solda, determinou as queimaduras. No quarto dia, avaliou-se a coloraçao, umidade e elasticidade para caracterizar macroscopicamente as queimaduras e mensurou-se a área das queimaduras dos grupos, nos quais aplicou-se o teste t de Student para comparar os resultados.
RESULTADOS: Evidenciaram-se, em todos os animais, queimaduras com coloraçao branca cerosa, seca e inelástica. Constatou-se uma área média das queimaduras 403,5±71,48mm² no GI e 403,7±71,19mm² no GII (p=0,995).
CONCLUSAO: O contato da peça cerâmica de 484mm² com pressao de massa de 54 gramas a 100° Celsius durante 30 segundos determinou queimaduras de espessura total de pele com área média semelhante entre os grupos, ao quarto dia de evoluçao, permitindo comparaçoes seguras entre GI e GII ao longo do tempo cicatricial.

Palavras-chave: Queimaduras. Modelos Animais. Métodos. Ratos Wistar.

ABSTRACT

INTRODUCTION: Skin burns are lesions usually caused by energy of heat transfer that determine a disordered cicatricial process, to understand it and to evaluate therapeutic possibilities are needed animal models, as well as the standardization of experimental burn.
OBJECTIVE: To describe a technique that promotes standardized burns of total skin thickness for experimental study in Wistar rats.
METHODS: Standardized burns were performed on 22 Wistar rats randomly divided into GI and GII. A ceramic piece of 484 mm² was attached to the end of a soldering iron, which in contact with the skin for 30 seconds at 100° Celsius at a pressure of 54 grams. On the fourth day, the staining, moisture and elasticity were evaluated to characterize the burns and the burn area of the groups was measured, in which Students t-test.
RESULTS: Burns characterized by waxy, dry and inelastic white color were observed in all the animals. It was found an average area of burns to 403.5±71.48mm² in GI and 403.7±71.19mm² in GII (p=0.995).
CONCLUSION: The contact of the ceramic piece of 484mm² with mass pressure of 54 grams at l00° Celsius for 30 seconds, determined total skin thickness burns with similar mean area groups, on the fourth day allowing the safe comparison between the groups over the cicatricial time.

Keywords: Burns. Models, Animal. Methods. Rats, Wistar.

INTRODUÇAO

As queimaduras sao lesoes traumáticas geradas por um insulto isolado de calor, frio, eletricidade, radiaçao ou produtos químicos, que atingem a pele ou qualquer outro órgao com destruiçao celular e tecidual. As queimaduras térmicas sao causadas por vapor, chamas, líquidos ou objetos quentes e dependem da duraçao, assim como da temperatura do contato com a pele acometendo geralmente a derme e epiderme¹. As queimaduras causam injúrias na superfície da pele, as quais determinam o início de uma sequência de eventos moleculares por mediaçoes bioquímicas, que intentam restaurá-la recuperando a homeostasia tecidual e orgânica², porém se diferenciam de outras lesoes pela intensa sobreposiçao das fases cicatriciais.

Como nao há sangramento, a fase inflamatória se inicia por extravasamento de fluídos, vasodilataçao e pela chegada dos neutrófilos e monócitos, que por meio de quimiocinas sustentam o recrutamento de macrófagos. Nesta fase, além da proteçao contra infeçoes, ocorre a degradaçao dos tecidos necróticos e se ativam sinalizaçoes reparatórias³. Além disso, o processo cicatricial se diferencia pelo extenso dano tecidual, com necrose dos tecidos subjacentes e comprometimento do suprimento sanguíneo por destruiçao celular e da rede vascular, o que diferencia de outras lesoes em que os tecidos permanecem com suprimentos e vitalizados sem prejuízo na ordenaçao da cascata de eventos^4,5.

A estimativa mundial de 11 milhoes de pessoas acometidas por ano⁴, com cerca de 265.000 mortes, em que as lesoes sao os determinantes letais, estabelece relevância aos estudos que almejam melhorias na terapêutica de recuperaçao das áreas das lesoes térmicas⁶. No âmbito mundial, os gastos em saúde alcançam anualmente 25 bilhoes de dólares, desconsiderando os gastos sociais com a perda da capacidade produtiva temporária ou definitiva⁷.

A incidência de queimaduras em países subdesenvolvidos é de 1,3 por 100.000 habitantes, enquanto que nos países desenvolvidos a incidência cai para 0,14 por 100.000 habitantes. As queimaduras correspondem à quarta causa mais frequente dos traumas, com maior incidência em países pobres com infraestrutura precária e onde há dificuldade para se implementar medidas preventivas.

A permanência hospitalar tem uma relaçao de um dia para cada 1% da superfície corpórea comprometida pelas queimaduras, em vítimas de até 70%⁸. A pele saudável mantém a homeostase do organismo pelo equilíbrio dos fluidos, pela regulaçao térmica, pela proteçao contra infecçoes e agressoes mecânicas, assim como permite a flexibilidade e firmeza em locais específicos⁹, porém, durante a vida, dificilmente uma pessoa nao seja vítima de uma queimadura, que pode comprometer esta habilidade tecidual. Certamente, a sensaçao desagradável deste instante e seus conseguintes, jamais será esquecida. Lancinante, a dor imediata sinaliza o desencadear de processos exacerbados, que prejudicam a lógica bioquímica da reparaçao tecidual¹⁰.

As queimaduras causam problemas estéticos, sociais e econômico, mas devido às restriçoes éticas há poucas possiblidades de promover pesquisa em humanos. Desta forma, tornam-se necessários estudos experimentais para compreender os detalhes das queimaduras¹¹. Os modelos animais sao utilizados em pesquisas para promover o entendimento fisiológicos das queimaduras, porém as aplicaçoes translacionais, ou seja, a transferência dos resultados de pesquisas em animais para os seres humanos estao atreladas às características diferenciadas existentes em cada raça.

Todavia, os modelos animais sao necessários para desvendar os mecanismos patológicos das queimaduras em relaçao aos aspectos moleculares e celulares, assim como para verificar efeitos de novas terapêuticas, caso contrário o entendimento da fisiopatologia se limitaria às características da evoluçao clínica¹². As queimaduras experimentais podem ser executadas pelo contato da pele do animal com materiais aquecidos ou soluçoes escaldantes, sempre sob anestesia geral¹³.

A padronizaçao das queimaduras depende da temperatura de contato ao longo do tempo e da força do peso da superfície aquecida que permanece em contato com a superfície cutânea. O controle sistemático destes parâmetros é fundamental para obter queimaduras com padroes semelhantes, assim como o desafio em manter e controlar a temperatura da superfície aquecida durante o período de tempo em contato com a pele¹¹.

O objetivo geral deste estudo foi detalhar uma técnica que promove queimaduras padronizadas de espessura total da pele em ratos Wistar.

Os objetivos específicos foram realizar uma queimadura controlada pelo contato de uma cerâmica aquecida com a superfície da pele do rato Wistar, comparar a média da superfície das queimaduras do grupo controle e do grupo experimento ao quarto dia e verificar se as características das lesoes correspondiam a queimaduras de espessura total da pele.


MÉTODO

O estudo experimental foi realizado no Instituto de Pesquisas Médica da Faculdade Evangélica do Paraná em conjunto com o Núcleo de Tecnologia Celular da Pontifícia Universidade Católica do Paraná de 2015 até 2017. Este trabalho foi aprovado pela Comissao de Ética no Uso de Animais da Faculdade Evangélica do Paraná, sob o número 3250/2015, que é regida pela Lei Federal 11794, de 08/10/2008.

Foram utilizados 22 ratos machos Wistar (Rattus Novergicus albinus) com 90 dias de idade com peso oscilando entre 250 e 280g, que foram separados em dois grupos de 11 animais, nos quais provocou-se uma queimadura de espessura total da pele. As lesoes, tanto do Grupo I (GI) quanto do Grupo II (GII), foram realizadas com o mesmo mecanismo, ou seja, pelo aquecimento de uma placa de cerâmica a 100° Celsius, acoplada na extremidade distal do ferro de soldar de uma estaçao analógica de solda.

Para efetuar as queimaduras, deixou-se a cerâmica em contato com a pele do animal pressionado apenas pelo peso do ferro de soldar em posiçao perpendicular por 30 segundos, tempo suficiente para determinar uma queimadura de espessura total da pele nos limites da superfície da placa¹⁴.

Os ratos receberam água e raçao padrao ad libitum e foram mantidos com a temperatura ambiente controlada entre 18 e 22° Celsius nas condiçoes próprias de umidade do ambiente com controle cíclico de luz e escuridao a cada 12 horas. Foram utilizadas seis gaiolas de polipropileno com 35x40x40 centímetros de dimensao. Tanto o GI como o GII, com 11 animais cada, foram etiquetados para identificaçao e mantidos sob as mesmas condiçoes.

Cada gaiola das seis utilizadas, locaram grupos de quatro animais. Todos os animais do GI e do GII permaneceram em jejum, prévio ao procedimento, por seis horas da raçao padrao e duas horas de água, e foram submetidos à anestesia geral com aplicaçao intramuscular de cetamina na dose de 50mg/Kg e xilazina na dose de 5mg/Kg.

Os procedimentos somente foram iniciados após a confirmaçao da imobilidade ao estímulo álgico, desta forma a suposiçao da inconsciência e da analgesia adequada, e esta anestesia profunda permaneceu até o término da cirurgia. Todos os ratos foram colocados em decúbito lateral direito, sobre uma mesa cirúrgica recoberta por um campo esterilizado. Nao foi utilizado nenhum método de fixaçao dos animais, os mesmos permaneceram imobilizados pelo próprio efeito dos anestésicos.

Realizou-se a tricotomia da regiao abdominal lateral esquerda, desde a borda inferior dos arcos costais até a regiao anterior da coxa esquerda, com lâmina de aço inoxidável. Em seguida, utilizou-se uma cédula quadrada de cerâmica com 220mm de extensao em cada lado e uma caneta com tinta preta. Colocou-se a cédula na regiao lateral abdominal esquerda a uma distância de 80mm da borda inferior do último arco costal com um dos lados paralelo à linha mediana do abdome.

Realizou-se a marcaçao com a tinta da caneta percorrendo toda a extensao dos lados cerâmica, que determinou um quadrado com área de 484mm². Utilizou-se para a confecçao das lesoes térmicas uma estaçao de solda com controle analógico da temperatura entre 200 e 480° Celsius. Adaptou-se na extremidade metálica de ferro uma cédula de cerâmica quadrada com 484mm² de área, idêntica à utilizada nas demarcaçoes cutâneas.

Estipulou-se a temperatura da base da cerâmica em 100° Celsius, que foi a superfície que ficou diretamente em contato com a pele. Para alcançar a temperatura desejada na cédula de cerâmica, manteve-se a estaçao de solda com temperatura constante em 250° Celsius. Controlou-se a temperatura da superfície da cédula de cerâmica, com um termômetro digital infravermelho com mira laser. No momento em que a temperatura havia alcançado 100° Celsius, posicionava-se o dispositivo verticalmente sobre a pele demarcada, apenas com a pressao de sua própria massa equivalente a 54g, por um período de 30 segundos, para estabelecer a queimadura de espessura total da pele com uma área de 484mm² (Figura 1).




Os animais do GI e do GII foram acompanhados na recuperaçao do procedimento anestésico-cirúrgico por seis horas, a deambulaçao e a ingestao de alimentos foram os critérios considerados na recuperaçao. Administrou-se no subcutâneo, para analgesia pós-operatória, o opioide do cloridrato de tramadol na dose de 5mg/Kg.

Após a recuperaçao anestésica, os ratos retornaram para suas gaiolas e continuaram a receber água e raçao ad libitum e foram mantidos com a temperatura ambiente controlada entre 18 e 22° Celsius nas condiçoes próprias de umidade do ambiente com controle cíclico de luz e escuridao a cada 12 horas.

Ao quarto dia após a realizaçao das queimaduras, repetiu-se para os animais do GI e do GII todos os procedimentos descritos no primeiro procedimento anestésico, para a obtençao de anestesia profunda e segura para a realizaçao dos procedimentos cirúrgicos. Novamente, os animais foram colocados em decúbito lateral direito, sobre uma mesa cirúrgica recoberta por um campo esterilizado sem nenhum método de fixaçao.

Realizou-se a mensuraçao da área queimada de cada animal, pela constataçao em milímetros da maior distância existente entre os lados opostos, os quais foram multiplicados obtendo-se a área. Estas medidas foram obtidas utilizando-se um paquímetro digital com régua analógica pela conferência da coincidência exata entre a escala milimétrica e o dado digital demonstrado no visor do aparelho (Figura 2).




Para averiguar a distribuiçao de normalidade das variáveis quantitativas, foi aplicado o teste de D'Agostino. Para os dados paramétricos em condiçao de normalidade da área da queimadura, utilizou-se o teste t de student para comparar as médias entre os grupos GC vs. GE. Os valores estao expressos em média ± desvio padrao. As análises estatísticas foram realizadas no programa GraphPad Prism versao 5.03 para Windows. Considerou-se significância resultados com p<0,05 nas avaliaçoes realizadas.

Verificou-se o aspecto das lesoes em busca dos critérios que caracterizam uma queimadura de espessura total de pele, ou seja, a coloraçao branca cerosa até o preto, seca, inelástica, sem branqueamento à pressao¹ (Figura 3).




RESULTADOS

Todos os animais sobreviveram até o quarto dia de evoluçao das queimaduras e nao apresentaram sinais de infecçao nas lesoes. Para avaliar a superfície das áreas queimadas, obteve-se a área do tecido cicatricial das queimaduras ao quarto dia, pela mensuraçao em centímetros da maior distância existente entre os lados opostos, os quais foram multiplicados obtendo-se a área (Quadro 1).




No quarto dia após a realizaçao das queimaduras, a área média de superfície das lesoes dos animais do GII nao demonstrou diferença estatística em relaçao ao GI (403,5±71,48 vs. 403,7±71,19 mm², p=0,995) (Gráfico 1).




Todos os animais do GI e GII apresentaram os critérios que caracterizam uma queimadura de espessura total de pele, ou seja, a coloraçao branca cerosa até o preto, seca, inelástica, sem branqueamento à pressao.


DISCUSSAO

Em todas as espécies, a pele possui como propriedade fundamental, o isolamento do organismo contra as hostilidades do ambiente externo, porém cada espécie possui características his-tológicas diferenciadas, que devem ser consideradas para comparaçoes da precisao translacional com a pele humana¹². Uma das preocupaçoes que assolam os profissionais envolvidos na resoluçao dos processos cicatriciais é a incerteza dos resultados, tanto estéticos quanto funcionais.

A incompreensao dos segredos que envolvem os processos cicatriciais limita as atuaçoes que poderiam auxiliar a prosperar a fisiologia da cura em sua plenitude. Infelizmente, nao é possível entender o processo cicatricial, pela simples observaçao de sua evoluçao, sem se aprofundar no estudo molecular e microscópico, ou seja, em seres humanos nao há viabilidade para se realizar este modelo de estudo. Para compreender estes mecanismos, diversas pesquisas estao em andamento, utilizando-se de diversos métodos e técnicas¹¹.

Ratos sao frequentemente utilizados em estudos pré-clínicos para verificaçao da eficácia terapêutica de tratamentos propostos. As vantagens preponderantes para sua escolha sao: processo cicatricial acelerado, padronizaçao racial, pequeno porte, custo reduzido e disponibilidade. Os modelos animais sao necessários para desvendar mecanismos patológicos das queimaduras em relaçao aos aspectos moleculares, celulares e para a observaçao dos efeitos de novas terapêuticas¹², como nesta pesquisa que na continuidade avaliou a influência das células tronco adultas no processo cicatricial de queimaduras, mas que necessita características semelhantes entre os grupos na fase inicial das queimaduras.

A pele do rato nao é igual à pele humana. O rato possui como vantagem a elasticidade da pele, que é pouco aderida às estruturas subjacentes, e possuir o paniculus carnosus, uma camada muscular fina no subcutâneo, capaz de contrair-se aproximando os bordos das lesoes e diminuindo a área cicatricial¹². Para diminuir estas vantagens da cicatrizaçao do rato em relaçao à humana, verificou-se que em superfícies queimadas maiores que 400mm² há uma perda deste mecanismo de contraçao¹³ e que a inibiçao da funçao do panniculus carnosus em queimaduras profundas possibilita uma evoluçao mais semelhante à da pele humana¹⁵.

Desta forma, optou-se nesta pesquisa pela realizaçao de queimaduras com área de 484mm² que acometeram toda a espessura da pele. As queimaduras podem ser executadas pelo contato da pele do animal com materiais aquecidos ou soluçoes escaldantes, sempre sob anestesia geral com agentes venosos ou inalatórios¹³, como efetuou-se neste estudo em que as queimaduras foram realizadas com uma placa de cerâmica aquecida sob anestesia geral venosa com cetamina associada à xilazina.

A necessidade de uma anestesia profunda e segura, que mantenha os reflexos protetores das vias aéreas e a estabilidade hemodinâmica, determinou a escolha da cetamina, um forte analgésico que produz intensa anestesia dissociativa preservando os reflexos protetores das vias aéreas, associada à xilazina, que mantém a imobilidade do animal. A dose preconizada para a cetamina varia de 15 a 100mg/Kg, enquanto que a dose da xilazina varia de 3 a 10 mg/Kg¹⁶. Nesta pesquisa estipulou-se doses intermediárias, assim os animais foram anestesiados com 50mg/Kg de cetamina e 5mg/Kg de xilazina intramuscular, que é uma dose semelhante a utilizada em ratos Sprague-Dawley antes da realizaçao da queimadura¹⁷.

A padronizaçao das queimaduras reduz os vieses de variabilidade das amostras e as características desejadas das queimaduras sao alcançadas pela observaçao do tempo, da temperatura e a pressao de contato do objeto que determina a lesao. A utilizaçao de uma placa de alumínio de 20mm com 330 gramas de pressao por 10 segundo a 60° Celsius, 65° Celsius e 70° Celsius reproduzem queimaduras de epiderme, espessura parcial superficial e espessura parcial profunda, respectivamente¹⁸.

A utilizaçao de um aparelho de solda com a ponta substituída por uma placa de alumínio com diâmetro de 23mm, temperatura 80° Celsius e tempo de exposiçao de 10 segundos determina queimaduras de terceiro grau até a regiao superficial do panniculus carnosus sob a pressao de contato exercida por 1Kg de massa¹⁹. As queimaduras provocadas em ratos podem ser realizadas pelo contato do aço, alumínio, latao, ferro de solda com força de peso variável entre 85g a 100g aquecidas em temperaturas entre 60 e 200° Celsius por dez segundos¹¹.

Embasados por estes autores e como neste trabalho a intençao era provocar queimaduras de espessura total, estendeu-se o tempo para 30 segundos com a temperatura em 100° Celsius mantendo a força de peso constante do aparelho de soldagem com a placa de cerâmica dependurados em uma barra fixa, o que proporcionou queimaduras padronizadas nos dois grupos. A mensuraçao da superfície das queimaduras pode ser utilizada comparar o tamanho e comparar as diferenças ou semelhanças entre os grupos²⁰, assim como nesse trabalho em que se utilizou a mensuraçao da área.


CONCLUSAO

O método utilizado para produzir queimaduras em ratos Wistar pelo contato da pele com uma peça cerâmica de 484 mm² utilizando uma pressao de massa de 54 gramas a 100° Celsius durante 30 segundos determinou queimaduras padronizadas de espessura total de pele, verificadas pelos critérios macroscópicos, em todos os animais de ambos os grupos. A constataçao de que a média de superfície de área foi semelhante entre os grupos com significância estatística, ao quarto dia de evoluçao, possibilita a comparaçao segura entre grupos ao longo do tempo cicatricial das fases proliferativas e de remodelaçao.


REFERENCIAS

1. Rice PL Jr, Orgill DP. Classification of burn injuries. Uptodate [Internet]; 2017 [acesso 2018 Jul 17]. Disponível em: https://www.uptodate.com/contents/classification-ofburn-injury

2. Pristo I. Cicatrizaçao de Feridas: Fases e Fatores de Influência. Acta Vet Bras. 2012;6(4):267-71.

3. Rowan MP, Cancio LC, Elster EA, Burmeister DM, Rose LF, Natesan S, et al. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critic Care. 2015;19:243.

4. Loder S, Peterson JR, Agarwal S, Eboda O, Brownley S, DeLaRosa S, et al. Wound healing after thermal injury is improved by fat and adipose-derived stem cell isografts. J Burn Care Res. 2015;36(1):70-6.

5. Rose LF, Chan RK. The Burn Wound Microenvironment. Adv Wound Care (New Rochelle). 2016;5(3):106-18.

6. Ozturk S, Karagoz H. Experimental stem cells therapies on burn wound: do source, dose, timing and method matter? Burns 2015;41(6):1133-9.

7. Dreifke MB, Jayasuriya AA, Jayasuriya AC. Current wound healing procedures and potential carer. Mater Sci Eng C Matter Biol Appl. 2015;48:651-62.

8. Peck MD. Epidemiology of Burn Injuries Globally. Up-to-date; [acesso 2018 Jul 17]. Disponível em: https://www.uptodate.com/contents/classification-of-burn-injury

9. Sorg H, Tilkorn DJ, Hager S, Hauser J, Mirastschijski U. Skin Wound Healing: An Update on the Current Knowledge and Concepts. Eur Surg Res. 2017;58(1-2):81-94.

10. Franck CL, Ribas Filho JM, Senegaglia AC, Leite LMB A complexidade cicatricial em queimaduras e a possibilidade da terapia com células-tronco derivadas do tecido adiposo: revisao. Rev Bras Queimaduras. 2017;16(2):111-6.

11. Arda MS, Koçman AE, Söztutar E, Baksan B, Çetin C. A new apparatus for standardization of experimental burn models. Burns. 2017;43(6):1322-9.

12. Abdullahi A, Amini-Nik S, Jeschke MG. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 2014;71(17):3241-55.

13. Dorsett-Martin WA. Rat models of skin wound healing: a review. Wound Repair Regen. 2004;12(6):591-9.

14. Meyer TN, Silva AL. Um modelo de queimadura padrao utilizando ratos. Acta Cir Bras. 1999;14(4).

15. Wong VW, Sorkin M, Glotzbach JP, Longaker MT, Urtner GC. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011;2011: 969618.

16. Schanaider A, Silva PC. Uso de animais em cirurgia experimental. Acta Cir Bras. 2014;19(4):441-7.

17. Prasai A, El Ayadi A, Mifflin RC, Wetzel MD, Andersen CR, Redl H, et al. Characterization of Adipose-Derived Stem Cells Following Burn Injury. Stem Cell Rev. 2017;13(6):781-92.

18. Guo HF, Ali RM, Hamid RA, Zaini AA, Khaza'ai H. A new model for studying deep partial-thickness burn in rats. Int J Burns Trauma. 2017;7(6):107-14.

19. Venter NG, Monte-Alto-Costa A, Marques RG. A new model for the standardization of experimental burn wounds. Burns. 2015;41(3):542-7.

20. Motamed S, Taghiabadi E, Molaei H, Sodeifi N, Hassanpour SE, Shafieyan S, et al. Cellbased skin substitutes accelerate regeneration of extensive burn wounds in rats. Am J Surg. 2017;214(4):762-9.c

Recebido em 19 de Setembro de 2018.
Aceito em 17 de Fevereiro de 2019.

Local de realização do trabalho: Hospital Metropolitano de Urgência e Emergência, Ananindeua, PA, Brasil.

Conflito de interesses: Os autores declaram não haver.